A pregabalina não é um agonista do receptor GABAA ou GABAB.
A pregabalina é um gabapentinóide e atua inibindo certos canais de cálcio. Especificamente, é um ligante do local auxiliar da subunidade α2δ de certos canais de cálcio dependentes de voltagem (VDCCs) e, portanto, atua como um inibidor de VDCCs contendo a subunidade α2δ. Existem duas subunidades α2δ de ligação ao fármaco, α2δ-1 e α2δ-2, e a pregabalina mostra afinidade semelhante (e, portanto, falta de seletividade entre) esses dois locais. A pregabalina é seletiva na sua ligação à subunidade α2δ VDCC. Apesar de a pregabalina ser um análogo do GABA, ela não se liga aos receptores GABA, não se converte em GABA ou outro agonista do receptor GABA in vivo e não modula diretamente o transporte ou metabolismo do GABA. No entanto, descobriu-se que a pregabalina produz um aumento dependente da dose na expressão cerebral da descarboxilase do ácido L-glutâmico (GAD), a enzima responsável pela síntese do GABA, e, portanto, pode ter alguns efeitos GABAérgicos indiretos, aumentando os níveis de GABA no cérebro. Atualmente não há evidências de que os efeitos da pregabalina sejam mediados por qualquer mecanismo diferente da inibição de VDCCs contendo α2δ. De acordo, a inibição de VDCCs contendo α2δ-1 pela pregabalina parece ser responsável pelos seus efeitos anticonvulsivantes, analgésicos e ansiolíticos.
Os α-aminoácidos endógenos L-leucina e L-isoleucina, que se assemelham muito à pregabalina e aos outros gabapentinóides na estrutura química, são ligantes aparentes da subunidade α2δ VDCC com afinidade semelhante à dos gabapentinóides (por exemplo, IC50 = 71 nM para L- isoleucina) e estão presentes no líquido cefalorraquidiano humano em concentrações micromolares (por exemplo, 12,9 μM para L-leucina, 4,8 μM para L-isoleucina). Foi teorizado que eles podem ser os ligantes endógenos da subunidade e que podem antagonizar competitivamente os efeitos dos gabapentinóides. De acordo, embora os gabapentinóides como a pregabalina e a gabapentina tenham afinidades nanomolares para a subunidade α2δ, as suas potências in vivo estão na gama micromolar baixa, e diz-se que a competição pela ligação por L-aminoácidos endógenos é provavelmente responsável por esta discrepância.

Descobriu-se que a pregabalina possui afinidade 6 vezes maior do que a gabapentina para VDCCs contendo a subunidade α2δ em um estudo. No entanto, outro estudo descobriu que a pregabalina e a gabapentina tinham afinidades semelhantes para a subunidade α2δ-1 recombinante humana (Ki = 32 nM e 40 nM, respectivamente). De qualquer forma, a pregabalina é 2 a 4 vezes mais potente que a gabapentina como analgésico e, em animais, parece ser 3 a 10 vezes mais potente que a gabapentina como anticonvulsivante.